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如何選擇合適的二抗?

發(fā)布時(shí)間: 2024-02-23  點(diǎn)擊次數(shù): 452次

二抗用于多種免疫測(cè)定中以檢測(cè)一抗的存在。這些抗體與酶、生物分子或熒光染料綴合,以允許檢測(cè)一抗。與一抗不同,二抗針對(duì)一抗的物種和同種型而產(chǎn)生,并用于通過(guò)在多個(gè)位置結(jié)合一抗來(lái)檢測(cè)一抗。

要成功選擇二抗,您應(yīng)該考慮以下因素:

確保良好匹配– 宿主物種是產(chǎn)生二抗的動(dòng)物,應(yīng)始終與一抗宿主不同。例如,如果您使用在兔中產(chǎn)生的一抗,則需要在兔以外的不同物種(如山羊、驢或小鼠)中產(chǎn)生的抗兔二抗(圖 1)。

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圖 1:二抗機(jī)制。

整個(gè)抗體還是片段?– 實(shí)際上,真正的問(wèn)題是“您的一抗是單克隆抗體還是多克隆抗體?" 這兩個(gè)問(wèn)題的答案通常取決于應(yīng)用程序。單克隆一抗含有單一同種型的免疫球蛋白。因此,使用特異性識(shí)別該同種型的二抗至關(guān)重要。此外,單克隆抗體通常在小鼠、兔和大鼠中培養(yǎng)。因此,如果一抗是小鼠 IgG1,您將需要抗小鼠 IgG 或特異性較低的 F(ab) 片段抗小鼠 IgG。抗體片段很適合免疫組織化學(xué)和免疫熒光,因?yàn)樗鼈兂叽巛^小且能夠穿透組織。然而,較小的尺寸可能會(huì)限制與片段綴合的染料或酶的選擇,導(dǎo)致二抗的靈敏度可能低于全抗體選擇。

多克隆一抗含有多種免疫球蛋白 G 同種型的混合物。因此,為了最大限度地檢測(cè)靶標(biāo),最好使用可識(shí)別所有同種型的二抗。多克隆通常在兔、山羊、綿羊和驢中飼養(yǎng),并以全抗體形式(重鏈 + 輕鏈),因此必須用來(lái)自不同物種的 IgG 庫(kù)對(duì)第二宿主物種進(jìn)行免疫,從而使純化的第二抗體能夠識(shí)別所有形式。例如,如果多克隆一抗是山羊 IgG,您將需要抗山羊 IgG (H+L)。然而,完整抗體可能會(huì)導(dǎo)致高背景和較低特異性,因?yàn)檩p鏈由所有免疫球蛋白共享,這會(huì)增加交叉反應(yīng)性(圖2)。

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圖 2:免疫測(cè)定中完整 IgG 二抗與片段二抗的結(jié)合機(jī)制。

根據(jù)您的應(yīng)用選擇結(jié)合物- 這取決于二抗如何檢測(cè)信號(hào)。例如,免疫組織化學(xué)、ELISA 和蛋白質(zhì)印跡應(yīng)用使用基于生物素標(biāo)記的比色和化學(xué)發(fā)光檢測(cè)來(lái)放大信號(hào)并提高靈敏度,以及與辣根過(guò)氧化物酶 (HRP) 或堿性磷酸酶 (AP) 作用的酶反應(yīng)。然而,對(duì)于免疫標(biāo)記、熒光顯微鏡和流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn),信號(hào)是使用熒光染料(例如 Alexa Fluor)檢測(cè)的,這些染料直接與抗體綴合以放大信號(hào)和靈敏度。

親和純化與交叉吸附抗體——此步驟用于增加抗體的特異性,可以區(qū)分親和純化和交叉吸附。大多數(shù)二抗都是通過(guò)親和層析純化的,從而產(chǎn)生高親和力抗體。此類抗體通常用于 IHC,因?yàn)樗鼈兲峁┳钚〉姆翘禺愋越Y(jié)合,以及用于檢測(cè)低豐度蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)印跡。交叉吸附的二抗通常要經(jīng)過(guò)額外的純化步驟,以濾除與非目標(biāo)免疫球蛋白種類結(jié)合的成員。此步驟增加了它們的特異性并減少了非特異性背景。這些抗體專為免疫組織化學(xué)等特定應(yīng)用而設(shè)計(jì)。

總之,二抗的選擇取決于當(dāng)前的應(yīng)用、靶標(biāo)豐度所需的靈敏度和純化水平以及非特異性結(jié)合的風(fēng)險(xiǎn)。


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